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線粒體復(fù)合體Ⅲ試劑盒說明書(可見分光光度法)
更新時(shí)間:2019-10-22 點(diǎn)擊量:1714

貨號(hào):YJ2445                                                     規(guī)格:25管/24樣

線粒體復(fù)合體Ⅲ試劑盒說明書

可見分光光度法

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

線粒體復(fù)合體Ⅲ(EC1.10.2.2) 又稱 CoQ-細(xì)胞色素C還原酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,負(fù)責(zé)把還原型 CoQ 的氫傳遞給細(xì)胞色素C,生成還原型細(xì)胞色素C。

測(cè)定原理

與氧化型細(xì)胞色素C不同,還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收,因此550nm光吸收增加速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅲ酶活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一:25mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑二:5mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑三:0.5 mL×1 支,-20℃保存;

試劑四:液體 20mL×1 瓶,4℃保存;

試劑五:粉劑×1 支,-20℃保存;

試劑六:液體 2.5mL×1 瓶,-20℃保存;

樣本的前處理:

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿600g,4℃離心 5min。

3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。

4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅲ(此步可選

做)。

5、步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅲ酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟:

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 550nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

(1)工作液的配制:臨用前把試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,置于 37℃(哺乳動(dòng)物)或

25℃(其它物種)孵育 5min;用不完的試劑 4℃可保存一周;

(2)在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 樣本、100μL 試劑六和 800μL 工作液,立即混勻,

記錄 550nm 處初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2,計(jì)算 ΔA=A2-A1。

復(fù)合體Ⅲ活力單位的計(jì)算:

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T

=615×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

(2) 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 還原型細(xì)胞色素 C 定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)

÷T=124×ΔA÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.248×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,9.4×10-4 L;ε:細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù),1.91×104L/mol/cm;

d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.04 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;

T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

 

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